Tributyltin (TBT) resistance in Aeromonas molluscorum Av27

Abstract

O tributilestanho (TBT) é considerado um dos xenobióticos mais tóxicos, produzidos e deliberadamente introduzidos no meio ambiente pelo Homem. Tem sido usado numa variedade de processos industriais e subsequentemente descarregado no meio ambiente. O tempo de meia-vida do TBT em águas marinhas é de várias semanas, mas em condições de anóxia nos sedimentos, pode ser de vários anos, devido à sua degradação mais lenta. Embora o TBT tenha sido descrito como sendo tóxico para eucariotas e procariotas, muitas bactérias podem ser resistentes a este composto. O presente trabalho teve como objetivo principal elucidar o mecanismo de resistência ao TBT em bactérias. Para além disso, pretendeu-se desenvolver um biorepórter para detectar TBT no ambiente. Para atingir estes objetivos foram delineadas várias tarefas cujos principais resultados obtidos se apresentam a seguir. Várias bactérias resistentes ao TBT foram isoladas de sedimento e água do Porto de Pesca Longínqua (PPL) na Ria de Aveiro, Portugal. Entre estas, Aeromonas molluscorum Av27 foi selecionada devido à sua elevada resistência a este composto (concentrações até 3 mM), à sua capacidade de degradar o TBT em compostos menos tóxicos (dibutilestanho, DBT e monobutilestanho, MBT) e também por usar o TBT como fonte de carbono. A. molluscorum Av27 foi caracterizada genotipica e fenotipicamente. Os fatores de virulência estudados mostraram que esta estirpe i) possui atividade lipolítica; ii) não é citotóxica para células de mamíferos, nomeadamente para células Vero; iii) não possui integrões de classe I e II e iv) possui cinco plasmídeos com aproximadamente 4 kb, 7 kb, 10 kb, 100 kb e mais de 100 kb. Estes resultados mostraram que a estirpe Av27 não é tóxica, aumentando assim o interesse nesta bactéria para futuras aplicações, nomeadamente na bioremediação. Os testes de toxicidade ao TBT mostraram que este composto tem um impacto negativo no crescimento desta estirpe, bem como, na densidade, no tamanho e na atividade metabólica das células e é responsável pela formação de agregados celulares. Assim, o TBT mostrou ser bastante tóxico para as bactérias interferindo com a atividade celular geral. O gene Av27-sugE, que codifica a proteína SugE pertencente à família das “small multidrug resistance proteins” (SMR), foi identificado como estando envolvido na resistência ao TBT nesta estirpe. Este gene mostrou ser sobreexpresso quando as células crescem na presença de TBT. O promotor do gene Av27-sugE foi utilizado para construir um bioreporter para detetar TBT, contendo o gene da luciferase do pirilampo como gene repórter. O biorepórter obtido reúne as características mais importantes de um bom biorepórter: sensibilidade (intervalo de limite de detecção de 1-1000 nM), rapidez (3 h são suficientes para a deteção de sinal) e, possivelmente, não é invasivo (pois foi construído numa bactéria ambiental). Usando sedimento recolhido no Porto de Pesca Longínqua da Ria de Aveiro, foi preparada uma experiência de microcosmos com o intuito de avaliar a capacidade de Av27 para bioremediar o TBT, isoladamente ou em associação com a comunidade bacteriana indígena. A análise das amostras de microcosmos por PCR-DGGE e de bibliotecas de 16S rDNA revelaram que a comunidade bacteriana é relativamente estável ao longo do tempo, mesmo quando Av27 é inoculada no sedimento. Para além disso, o sedimento estuarino demonstrou ser dominado por bactérias pertencentes ao filo Proteobacteria (sendo mais abundante as Delta e Gammaproteobacteria) e Bacteroidetes. Ainda, cerca de 13% dos clones bacterianos não revelaram nenhuma semelhança com qualquer dos filos já definidos e quase 100% afiliou com bactérias não cultiváveis do sedimento. No momento da conclusão desta tese, os resultados da análise química de compostos organoestânicos não estavam disponíveis, e por essa razão não foi possível tirar quaisquer conclusões sobre a capacidade desta bactéria remediar o TBT em sedimentos. Esses resultados irão ajudar a esclarecer o papel de A. molluscorum Av27 na remediação de TBT. Recentemente, a capacidade da estirpe Av27 remediar solo contaminado com TBT foi confirmada em bioensaios realizados com plantas, Brassica rapa e Triticum aestivum (Silva 2011a), e também com invertebrados Porcellionides pruinosus (Silva 2011B). Assim, poder-se-á esperar que a bioremediação do sedimento na experiência de microcosmos também tenha ocorrido. No entanto, só a análise química dos compostos organostânicos deverá ser conclusiva. Devido à dificuldade em realizar a análise analítica de organoestânicos, um método de bioensaio fácil, rápido e barato foi adaptado para avaliar a toxicidade do TBT em laboratório, antes de se proceder à análise química das amostras. O método provou a sua utilidade, embora tenha mostrado pouca sensibilidade quando se usam concentrações de TBT baixas. Em geral, os resultados obtidos contribuíram para um melhor entendimento do mecanismo de resistência ao TBT em bactérias e mostraram o potencial biotecnológico de A. molluscorum Av27, nomeadamente, no que refere à sua possível aplicação na descontaminação de TBT no ambiente e também no desenvolvimento de biorepórteres.

Tributyltin (TBT) is considered as one of the most toxic xenobiotics, ever produced and deliberately introduced into the environment by Man. It has been used in a variety of industrial processes and subsequently discharged into the environment. The typical half-life of TBT in marine waters is of several weeks, but in deeper anoxic sediments it may be of several years, due to its slower degradation. Although TBT has been reported to be toxic to both eukaryotes and prokaryotes, bacteria can be resistant to this compound. In the present work a major goal was outlined: to elucidate the TBT resistance mechanism in bacteria. Additionally, it was also an objective developing a bioreporter to detect TBT in the environment. For this purpose a number of tasks were delineated and the main results obtained are bellow described. Several resistant bacteria were isolated from sediment and water at Porto de Pesca Longínqua (PPL) site in Ria de Aveiro, Portugal. Among those, Aeromonas molluscorum Av27 was selected due to its high resistance to TBT (up to 3 mM), its ability to degrade this compound into less toxic compounds (dibutyltin, DBT and monobutyltin, MBT) and also because it uses TBT as carbon source. A. molluscorum Av27 was genotypically and phenotypically characterized. The virulence factors studied showed that Av27 strain: i) has lipolytic activity; ii) is not cytotoxic for mammal cells, namely Vero cells; iii) does not have class I and II integrons and iv) possesses five plasmids with approximately 4 kbp, 7 kbp, 10 kbp, 100 kbp and more than 100 kbp. These results demonstrated that Av27 strain is not toxic, increasing the interest on this bacterium for future applications, namely bioremediation. Different growth parameters were studied revealing that a temperature of 25°C, a salinity range from 1 to 4% and a pH between 6 and 9 were the optimal growth conditions to Av27 strain. Regarding the antibiotic resistance profile, A. molluscorum Av27 is resistant to penicillin (10 μg), amoxicillin/clavulanic acid (30 μg) and cephalothin (30 μg) and also to the vibriostatic agent O/129; moreover, Av27 strain uses various compounds as carbon and energy source. TBT toxicity tests showed that this compound has a negative impact on bacterial growth, cell density, cell size and metabolic activity and promoted the formation of cell aggregates. Thus, TBT was found to be very toxic for this bacterium interfering with general cell activity. A gene, Av27-sugE, encoding the SugE protein belonging to the small multidrug resistance (SMR) proteins family was identified to be involved in the TBT resistance in this strain. This gene showed to be over-expressed when cells grow in the presence of TBT. Based on the Av27-sugE putative promoter, a bioreporter for TBT was constructed, containing the firefly luciferase as the reporter gene. The obtained bioreporter gathers the most important characteristics of a good bioreporter: sensitivity (detection limit range from 1-1000 nM), fastness (3 h for signal detection) and possibly non-invasive (it was constructed in an environmental bacterium). A microcosm experiment using estuarine sediment from PPL, Ria de Aveiro, was established to evaluate the ability of Av27 to bioremediate TBT, alone or in association with the indigenous bacterial community. PCR-DGGE and 16S rDNA libraries analysis of the microcosm samples revealed that the bacterial community is relatively stable over time, even when Av27 is inoculated in the sediment. Additionally, the estuarine sediment demonstrated to be dominated by bacteria belonging to the phyla Proteobacteria (among the most abundant Delta and Gammaproteobacteria) and Bacteroidetes. Moreover, about 13% of the bacterial clones showed no similarity to any of the phyla already defined and almost 100% affiliated with unculturable sediment bacteria. At the time of conclusion of this thesis, the results of organotin compounds chemical analysis were not available; therefore it was not possible to draw any conclusions about the TBT remediation in microcosm. Those results will help clarify the role of A. molluscorum Av27 in the remediation of TBT. Recently the ability of Av27 strain to remediate soil contaminated with TBT was confirmed in bioassays performed with plants, Brassica rapa and Triticum aestivum (Silva 2011a) and also invertebrates Porcellionides pruinosus (Silva 2011b). Thus it could also be expected that bioremediation of the sediment from the microcosm experiment has also occurred. Still only the organotin chemical analysis shall be conclusive. Due to the difficulty in performing analytical analysis, an easy, rapid, and inexpensive bioassay method was adapted to monitor TBT toxicity in the laboratory, prior to chemical analysis. The method proved its usefulness albeit showing low sensitivity when low TBT concentrations are used. Overall, the results obtained contributed to the elucidation of TBT resistance in bacteria and revealed the biotechnological potential of A. molluscorum Av27, namely in its possible application to decontaminating TBT in the natural environment and also in the development of bioreporters.